近日，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學課題組在Genome Biology（《基因組生物學》）發表了題為“Doxycycline-dependent Cas9-expressing pig resources for conditional in vivo gene nullification and activation”的研究論文，該研究構建了可通過小分子藥物靈活調控基因剪刀蛋白Cas9表達的工具豬，利用該工具模型，實現了成體大動物體內高效基因編輯，并首次構建了大動物原發性可轉移的胰腺導管腺癌模型。

　　豬不僅是重要的農業經濟動物，也是重要的醫學動物模型。隨著基因編輯技術的發展，特別是CRISPR/Cas9技術的出現，越來越多具有重要應用價值的基因修飾豬模型被培育出來。構建這些模型主要通過受精卵注射或體細胞核移植技術來實現。然而，通過受精卵注射方式獲得的基因編輯動物往往是嵌合體，需通過進一步的繁殖才能獲得目標基因型，通過體細胞核移植方式獲得基因編輯動物涉及復雜、低效的體細胞克隆過程，耗時、耗力且成本極高。

　　為了解決以上問題，賴良學課題組多年來一直致力于培育嵌入基因剪刀（Cas9蛋白）的工具豬模型，早在2017年，培育出了以Cre重組酶為開關來啟動Cas9蛋白表達的工具豬，首次實現了對成體大動物直接進行體內基因編輯，并將其成功地用于原發性肺癌模型的建立（Genome Research, 2017）。但該工具豬模型的應用需要在體內遞送入Cre重組酶，其過程復雜、昂貴，且效率較低。另外，Cre重組酶對Cas9蛋白表達的啟動是永久性的，而Cas9蛋白在體內的持續表達，會引起基因組損傷、脫靶效應及免疫反應等不利影響。

　　四環素誘導基因表達系統可通過簡單的小分子藥物Dox靈活地調控外源基因的表達時間與表達量，且具有簡單、高效及易操作的特點。2022年，賴良學課題組通過基因編輯技術將該調控系統引入豬體內，培育出了Dox誘導外源基因表達工具豬模型，并證明了其對任意外源基因的可調控表達的有效性（Science China Life Sciences, 2022）。在本次研究成果中，研究人員進一步將Dox誘導外源基因表達系統和Cas9蛋白一起嵌入豬體內，培育出了帶有升級版基因剪刀的工具豬。

　　研究人員首先證實，小分子藥物可對工具豬體內的Cas9蛋白表達時間和表達劑量加以靈活調控，即Cas9表達由藥物施用與撤除而加以啟動和關閉，而表達量受給藥劑量控制。另外，通過對懷孕母豬進行藥物處理，小分子藥物Dox可跨過胎盤屏障，實現胎兒體內剪刀蛋白Cas9的高效誘導表達。接著，研究人員進一步證實，誘導表達的剪刀蛋白Cas9不僅可以切割基因組，導致基因失活及染色體重排，還可以采用截短失活型sgRNA及轉錄激活蛋白組合，實現內源靶標基因的表達激活。

　　為了驗證利用該工具模型進行體內基因編輯的效果，研究人員將包裝有靶向兩個抑癌基因（TP53、LKB1）的sgRNAs和人KRASG12D表達框的腺相關病毒通過胰腺導管和/或直接胰體注射至胰腺內，誘導產生致癌基因突變。21周后，豬出現明顯的腹脹和攝食減少，PET-CT結果顯示腹腔內出現明顯的代謝信號異常，解剖結果顯示，胰腺內出現大量腫瘤，并且已轉移至肝臟、腸及膈膜等器官/組織，組織切片結果也顯示出現了典型的胰腺導管腺癌病理變化。

　　研究團隊獲得的Dox誘導Cas9表達豬模型，將為直接進行體內基因編輯、體內基因文庫篩選及體內基因表達調控提供理想的工具。

　　另外，研究人員還在該工具基礎上，通過時空調控Cas9表達，建立了一步體細胞克隆法即可獲得能夠穩定遺傳的時空特異性單或多基因敲除豬模型的策略，為后續構建各種用途的新型條件性基因敲除豬模型提供了極大便利，也為細胞譜系示蹤模型構建、基因治療過程中Cas9蛋白的安全性評估等研究提供理想的工具。

　　本研究中，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學課題組金琴副研究員、劉曉藝博士研究生、莊鎮鵬博士研究生以及廣東省實驗動物監測所黃家園博士為共同第一作者，賴良學研究員和王可品研究員為共同通訊作者。該研究成果得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、海南省重大科技計劃、中國科學院青年創新促進會和中國科協青年人才托舉工程等項目的資助。

　　論文鏈接

　　Dox誘導Cas9表達工具豬模型培育與應用

　　（A）Dox誘導Cas9蛋白表達原理圖；（B）原代Dox誘導Cas9表達工具豬照片；（C）基于Dox誘導Cas9表達工具豬構建原發性胰腺導管腺癌模型示意圖；（D）原發性胰腺導管腺癌及其轉移器官/組織照片；（E）Dox誘導Cas9表達工具豬的應用領域